Ngwaahịa
Ngwa ihe nchọpụta Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR maka 2019-nCoV
Ojiji tụrụ anya
A na-eji ngwa a maka nchọpụta qualitative nke ọhụrụ coronavirus (2019-nCoV) na-eji akpịrị swabs, nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum.Nchọpụta nchọpụta nke ngwaahịa a bụ naanị maka nkọwa ụlọ ọgwụ, na e kwesịghị iji ya dị ka naanị ya. ihe akaebe maka nchoputa na ọgwụgwọ ụlọ ọgwụ. A na-atụ aro nyocha zuru oke nke ọnọdụ ahụ na-ejikọta ya na ngosipụta ụlọ ọgwụ nke onye ọrịa na nyocha ụlọ nyocha ndị ọzọ.
Ụkpụrụ nyocha
Ngwa ahụ dabere na teknụzụ RT- PCR otu nzọụkwụ.N'ezie, 2019 coronavirus ọhụrụ (2019-nCoV) ORF1ab na mkpụrụ ndụ ihe nketa ahọpụtara dị ka mpaghara ebumnuche nkwalite.Nkọwapụta akọwapụtara na nyocha fluorescent (N nyocha mkpụrụ ndụ ihe nketa FAM na ORF1ab nyocha ka akpọrọ HEX) iji chọpụta ụdị 2019 coronavirus RNA ọhụrụ na nlele.Ngwa ahụ gụnyekwara usoro nchọpụta njikwa ime endogenous (nyocha mkpụrụ ndụ ihe n'ime ime nke akpọrọ CY5) iji nyochaa usoro nchịkọta nlele, mmụba RNA na PCR, si otú ahụ belata nsonaazụ ọjọọ.
Isi ihe
| Ngwa | Olu(48T/Kit) |
| Ngwọta mmeghachi omume RT-PCR | 96ml |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Njikwa adịghị mma | 1500µl |
| nCOV mma contro (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Reagents nke onwe: mmịpụta RNA ma ọ bụ reagents dị ọcha.Njikwa na-adịghị mma / nti: njikwa dị mma bụ RNA nwere iberibe ebumnuche, ebe njikwa na-adịghị mma bụ mmiri enweghị acid nucleic.N'oge eji, ha kwesịrị isonye na mmịpụta ahụ ma bụrụ ndị a na-ewere dị ka ọrịa.Ekwesịrị ijikwa ma tụfuo ha dịka iwu ndị dị mkpa siri dị.
Mkpụrụ ndụ ihe nketa dị n'ime bụ mkpụrụ ndụ RnaseP mmadụ.
Ọnọdụ nchekwa na ụbọchị ngafe
-20 ± 5 ℃, zere oyi ugboro ugboro na thawing karịa 5 ugboro, dị irè maka ọnwa 6.
Ngwa ọdabara
Na FAM / HEX / CY5 na ọtụtụ ọwa fluorescent PCR ngwaọrụ.
Ihe atụ chọrọ
1. Ọdabara ụdị ụdị: akpịrị swabs, nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum.
2.Specimen collection (aseptic technique)
Pharyngeal swab: Jiri swabs abụọ hichaa tonsils na azụ pharyngeal mgbidi n'otu oge, wee minye isi swab n'ime tube ule nwere ngwọta nlele.
Sputum: Mgbe onye nrịanrịa nwesịrị ụkwara miri emi, kpokọta sputum ụkwara n'ime tube nyocha nke screw cap nwere ihe nlele;Mmiri lavage bronchoalveolar: Nlere anya nke ndị ọkachamara ahụike.3. Nchekwa na njem nke samples
Ekwesịrị ịnwale ụdịdị maka iche nje na nnwale RNA ozugbo enwere ike.Enwere ike ịchekwa ihe nlele nke enwere ike ịchọta n'ime awa 24 na 4 ℃;ndị na-enweghị ike ịchọpụta n'ime 24
awa kwesịrị ịchekwa na -70 ℃ ma ọ bụ n'okpuru (ọ bụrụ na e nweghị nchekwa ọnọdụ nke -70 ℃, ha kwesịrị ịbụ.
echekwara nwa oge na -20 ℃ refrigerator).Ihe nlere kwesịrị ịzenarị oyi na-agbaze ugboro ugboro n'oge njem.Ekwesịrị iziga ihe nlele na ụlọ nyocha ozugbo enwere ike ịnakọtachara.Ọ bụrụ na ọ dị mkpa ka ebufe ihe nlele n'ebe dị anya, a na-atụ aro nchekwa akpụrụ akpụ.
Ụzọ ule
1 Nhazi nlele na mmịpụta RNA (mpaghara nhazi ihe nlele)
A na-atụ aro ka ị were 200μl nke ihe nlele mmiri maka mmịpụta RNA.Maka usoro mmịpụta emetụtara, rụtụ aka na ntuziaka nke ngwa mmịpụta RNA azụmahịa.Ma nke na-adịghị mma na nke na-adịghị mma
njikwa na ngwa a so na mmịpụta ahụ.
2 PCR reagent nkwadebe (ebe nkwadebe reagent)
2.1 Wepu ihe niile na ngwa ahụ wee mebie ma gwakọta ya na ụlọ okpomọkụ.Centrifuge na 8,000 rpm maka sekọnd ole na ole tupu eji;gbakọọ ego reagents achọrọ, ma kwadebere usoro mmeghachi omume dịka egosiri na tebụl na-esonụ:
| Ngwa | N na-eje ozi (usoro 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Ngwọta mmeghachi omume RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = ọnụọgụ nlele nwalere + 1 (nchịkwa na-adịghị mma) + 1 (nCOVnjikwa ziri ezi) | |
2.2 Mgbe ị gwakọtara ihe ndị ahụ nke ọma, centrifuge maka obere oge ka mmiri niile dị na mgbidi tube daa na ala nke tube ahụ, wee tinye usoro nkwalite 20 µl n'ime PCR tube.
3 Sampling (mpaghara nkwadebe ihe atụ)
Tinye 5μl nke njikwa adịghị mma na nke dị mma mgbe mmịpụta gasịrị.A na-agbakwunye RNA nke ihe nlele a ga-anwale na tube mmeghachi omume PCR.
Kpuchie tube ahụ nke ọma na centrifuge na 8,000 rpm maka sekọnd ole na ole tupu ebufe ya na mpaghara nchọpụta mmụba.
4 PCR amplification (mpaghara nchọpụta abawanye)
4.1 Tinye tube mmeghachi omume n'ime cell sample nke ngwá ọrụ, ma tọọ paramita dị ka ndị a:
| ogbo | okirikiri nọmba | Okpomọkụ(°C) | Oge | nchịkọtasaịtị |
| tụgharịaederede | 1 | 42 | Nkeji 10 | - |
| Tupu denaturationn | 1 | 95 | 1 min | - |
| okirikiri | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | nchịkọta data |
Nhọrọ ọwa nchọpụta akụrụngwa: Họrọ ọwa FAM, HEX, CY5 maka mgbama fluorescence.Maka ntụaka fluorescent, biko ahọrọla ROX.
Nyocha nsonaazụ 5 (Biko rụtụ aka na ntuziaka nnwale nke ngwa ọ bụla maka ịtọ ntọala)
Mgbe mmeghachi omume ahụ gasịrị, chekwaa nsonaazụ ya.Mgbe nyochachara, gbanwee uru mmalite, njedebe njedebe, na ọnụ ahịa ọnụ ụzọ nke ntọala dị ka onyinyo ahụ si dị (onye ọrụ nwere ike gbanwee dịka ọnọdụ ahụ dị n'ezie, enwere ike ịtọ uru mmalite na 3 ~ 15, ọnụ ahịa njedebe nwere ike ịtọ. 5 ~ 20, mgbanwe) na eserese logarithmic N'ọnụ ụzọ nke windo ahụ, ahịrị ọnụ ụzọ dị na mpaghara logarithmic, na nkwubi okwu nke njikwa na-adịghị mma bụ ahịrị kwụ ọtọ ma ọ bụ n'okpuru ahịrị ọnụ ụzọ).
6 Quauty Control (A na-agụnye njikwa usoro na ule) njikwa adịghị mma: Enweghị usoro nkwalite doro anya maka FAM, HEX, CY5 detection channelsn
COV nti njikwa: doro anya nkwuwa usoro nke FAM na HEX ọwa nchọpụta, Ct uru≤32, ma ọ dịghị nkwalite usoro nke CY5 ọwa;
Ihe ndị a chọrọ n'elu ga-ezute n'otu oge n'otu nnwale ahụ;ma ọ bụghị ya, nnwale ahụ abaghị uru ma ọ dị mkpa ka emegharịa ya ọzọ.
7 Mkpebi nsonaazụ.
7.1 Ọ bụrụ na enweghị nkwalite nkwalite ma ọ bụ uru Ct> 40 na FAM na ọwa HEX nke nlele ule, yana enwere mmụba na ọwa CY5, enwere ike ikpebi na ọ nweghị coronavirus ọhụrụ 2019 (2019-nCoV) RNA na sample;
.2 Ọ bụrụ na ihe nlele ahụ nwere nkwubi okwu pụtara ìhè na ọwa FAM na HEX, yana uru Ct bụ ≤40, enwere ike ikpebi na nlele ahụ dị mma maka coronavirus ọhụrụ 2019 (2019-nCoV).
7.3 Ọ bụrụ na ihe nlele ahụ nwere nkwubi okwu doro anya naanị n'otu ọwa nke FAM ma ọ bụ HEX, yana uru Ct bụ ≤40, ma ọ nweghị mgbatị nkwalite na ọwa nke ọzọ, ọ dị mkpa ka a nwaleghachi nsonaazụ ya.Ọ bụrụ na nsonaazụ nnwale ahụ na-agbanwe agbanwe, enwere ike ikpebi ihe nlele ahụ dị mma maka nke ọhụrụ
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Ọ bụrụ na nsonaazụ nnwale ahụ adịghị mma, enwere ike ikpebi na nlele ahụ adịghị mma maka coronavirus ọhụrụ 2019 (2019-nCoV).
Uru ikpe ziri ezi
A na-eji usoro mgbagharị ROC iji chọpụta uru CT ntụaka nke ngwa ahụ yana uru ntụaka njikwa ime bụ 40.
Nkọwa nke nsonaazụ ule
1.A ga-anwale nnwale ọ bụla maka njikwa na-adịghị mma na nke ọma.Enwere ike ikpebi nsonaazụ ule naanị mgbe njikwa na-emezu ihe achọrọ njikwa mma
2.Mgbe FAM na ọwa nchọpụta HEX dị mma, nsonaazụ sitere na ọwa CY5 (ọwa njikwa ime) nwere ike ịdị njọ n'ihi asọmpi usoro.
3.Mgbe nsonaazụ nchịkwa nke ime na-adịghị mma, ma ọ bụrụ na ọwa nyocha FAM na nyocha HEX na-adịghị mma, ọ pụtara na usoro ahụ nwere nkwarụ ma ọ bụ ọrụ ahụ adịghị mma, t ule ahụ adịghị mma.Ya mere, ọ dị mkpa ka enyochagharị ihe nlele ahụ.
